Microscopia adattiva a contrasto di fase per compensare l'effetto menisco

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 5785 (2023) Citare questo articolo

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Il contrasto di fase è uno dei metodi microscopici più importanti per rendere visibili le cellule trasparenti e non colorate. Le colture cellulari vengono spesso coltivate in piastre per microtitolazione, costituite da diversi pozzetti cilindrici. La tensione superficiale del mezzo di coltura forma una lente liquida all'interno del pozzetto, causando il fallimento delle condizioni di contrasto di fase nelle aree dei bordi più curvi, impedendo l'osservazione delle cellule. La microscopia adattiva a contrasto di fase è un metodo per aumentare notevolmente l'area osservabile compensando otticamente l'effetto menisco. L'anello del condensatore del microscopio è sostituito da un LCD trasmissivo per consentire cambiamenti dinamici. Nel percorso di illuminazione viene posizionato un prisma deformabile riempito di liquido. L'angolo della superficie del prisma è inclinato in modo adattivo per rifrangere la luce trasmessa in modo che l'angolo tangenziale della lente liquida possa essere compensato. Oltre all'osservazione dell'immagine a contrasto di fase, un divisore di fascio consente di visualizzare simultaneamente l'anello del condensatore e lo spostamento dell'anello di fase. Gli algoritmi analizzano lo spostamento per regolare dinamicamente il display LCD e il prisma per garantire condizioni di contrasto di fase. Gli esperimenti mostrano un aumento significativo dell'area osservabile, soprattutto per pozzi di piccole dimensioni. Per le piastre da 96 pozzetti, è possibile esaminare più di dodici volte l'area in condizioni di contrasto di fase invece che con la microscopia a contrasto di fase standard.

La microscopia a contrasto di fase, proposta per la prima volta nel 1932 da Frits Zernike1, è un metodo ampiamente utilizzato per osservare campioni biologici perché può rendere visibili cellule trasparenti e non colorate2. A causa delle interferenze, gli sfasamenti della luce passante possono essere resi visibili per aumentare il contrasto negli oggetti semitrasparenti.

Tuttavia, le sue applicazioni sono limitate dall'effetto menisco, che colpisce in particolare i campioni contenuti in micropiastre con 96 o più pozzetti3. Misurazioni di riferimento hanno dimostrato che nelle piastre a 6 pozzetti, le condizioni di contrasto di fase possono essere trovate nel 25% (235 mm2 di 950 mm2) della superficie del pozzetto. Nelle piastre a 96 pozzetti è solo il 2,3% (0,84 mm2 su 36,3 mm2)4.

Il contrasto di fase è un metodo di microscopia a luce trasmessa in cui un anello condensatore viene posizionato nel percorso del raggio di illuminazione e la luce nell'obiettivo viene guidata attraverso un anello di fase (vedere Fig. 1). Se l'immagine dell'anello del condensatore e l'anello di fase si sovrappongono, si verificano condizioni di contrasto di fase. Gli spostamenti di fase si verificano in corrispondenza delle transizioni nel campione osservato, come i confini delle cellule, che vengono evidenziati otticamente. Le condizioni di contrasto di fase possono essere facilmente identificate dall'effetto "alone", che è una regione con uno sfondo scuro e bordi luminosi attorno agli oggetti che sfasano2,6.

Rappresentazione schematica del percorso di illuminazione in un microscopio a contrasto di fase con diverse posizioni dei pozzetti. (A) Percorso luminoso semplificato attraverso il microscopio (elementi non attivi come specchi deflettori e lastre di vetro sono stati omessi). (1) Sorgente luminosa (2) Anello del condensatore (3) Lente del condensatore (5) MTP (6) Lente dell'obiettivo (7) Anello di fase (8) Specchio mobile (9) Lente di Bertrand (10) Lente oculare (11) Fotocamera secondaria ( 12) Obiettivo del tubo (13) Fotocamera principale. Muovendo lo specchio (8), è possibile commutarlo tra il percorso luminoso principale (I) e il percorso luminoso secondario (II) per osservare la sovrapposizione dell'anello di fase e dell'anello del condensatore. (B) La luce passa attraverso il centro del pozzo. (B.1) Immagine di sovrapposizione dell'anello di fase e dell'anello del condensatore. Si sovrappongono completamente. (B.2) Immagine a contrasto di fase risultante della coltura cellulare. (C) A causa della curvatura della superficie verso il bordo del pozzo, il fascio luminoso viene rifratto lontano dal centro. (C.1) Nell'immagine di sovrapposizione, è visibile la deviazione tra l'anello del condensatore (2) e l'anello di fase (7). (C.2) L'immagine cellulare risultante viene quindi acquisita in condizioni di campo chiaro. Le immagini (A.2) e (B.2) sono state scattate con un obiettivo 10x (Nikon CFI Plan Fluor DL ​​10XF) in un MTP a 6 pozzetti.